Determinación de pesticidas orgánicos en vino: proceso de laboratorio y técnicas analíticas

1. Toma de muestra

Vamos a la bodega de donde procede el vino a realizar la toma de muestra. Al no conocer una información precisa sobre la distribución del analito (tóxico) en la muestra, hablamos de una estrategia para la toma de muestra basada en criterios probabilísticos, de forma que seleccionamos muestras al azar que sean lo suficientemente representativas del conjunto del material a analizar. Llevamos las muestras al laboratorio en botellas de vidrio porque, al ser pesticidas orgánicos, en recipientes de vidrio evitamos la contaminación positiva (algún constituyente del material se transfiere a la muestra) y negativa (el analito se adsorbe sobre las paredes del recipiente).

2. Preparación de la muestra

De la muestra bruta que llega al laboratorio, hago un submuestreo manteniendo la representatividad que hemos tenido en cuenta en el muestreo. Al ser un líquido, la muestra es homogénea y, para evitar el paso de algún sólido en suspensión a la etapa de medida, filtramos. Luego, la muestra ya filtrada la alicuotamos en viales de 1 ml y llevamos a congelación. El hecho de que sean alícuotas de 1 ml es porque así evito procesos de congelación y descongelación repetidos. Como es un líquido, no necesita procesos de solubilización, así que pasamos directamente a la etapa de eliminación de interferencias.

3. Extracción líquido-líquido

En esta etapa nos encontramos un caso de extracción líquido-líquido. El objetivo prioritario de esta etapa es separar analito e interferente (aumenta la selectividad) y el secundario, la preconcentración del analito (aumento de sensibilidad). En esta etapa ponemos en contacto 2 fases:

• Fase I: acuosa (analito + interferente)
• Fase II: líquida (disolvente orgánico inmiscible)

Ya que la Fase I es polar, la Fase II que cogemos es de naturaleza apolar. Para este proceso hay una serie de variables que tengo que controlar, ya que van a interactuar en la efectividad (rendimiento) del proceso:

1. Selección del disolvente que vamos a utilizar como extractante: teniendo en cuenta la solubilidad del analito en él.
2. Relación de volúmenes que tengo que enfrentar: Sabemos que la solubilidad del analito en cuestión es del orden de magnitud 2 o 3 veces mayor en la fase orgánica que en la fase acuosa, luego podemos trabajar con proporción 1:1.
3. Optimización del pH: Como el analito está implicado en un proceso ácido-base, he de optimizar el pH. A mí me interesa el medio no ionizado, porque así el analito será más soluble en disolventes orgánicos.
4. Efecto salino: añado sales a la fase acuosa, de forma que esas sales son solvatadas por la fase acuosa, debilitándose así la unión analito-fase acuosa. De esta forma, el analito se transfiere a la fase orgánica más fácilmente.

4. Separación cromatográfica

Ya que tenemos un compuesto orgánico en una matriz con actividad enzimática que puede sufrir metabolismo o transformación, haremos una separación cromatográfica. En base a las propiedades fisicoquímicas de la fase móvil, haremos una cromatografía líquida (los compuestos menos retenidos en la fase estacionaria están siendo más solubilizados por la fase móvil). En cuanto a la fase estacionaria, elegimos una fase estacionaria de naturaleza líquida (cromatografía de reparto). Vamos a llevar el proceso de cromatografía líquida en columna en modo isocrático (a lo largo del desarrollo cromatográfico utilizo la misma fase móvil) reverso (fase móvil polar, fase estacionaria apolar).

5. Sistema de detección

Respecto al sistema de detección, vamos a utilizar 2 detectores en línea:

• Detector de amperometría de oxidación: En esta técnica tenemos una celda de medida en la que metemos nuestro analito, el medio iónico y el tampón. Junto a la celda tenemos también un electrodo de trabajo (al ser amperometría de oxidación, el rango de potencial en el que mido va entre 0 V hasta 1,2 V. El electrodo está constituido por carbono), un electrodo de referencia y un tercer electrodo auxiliar (en su superficie va a descargarse la resistencia al paso de corriente eléctrica que se dé en la celda; está constituido por una barra de platino) o contraelectrodo. Aplico a la superficie del electrodo de trabajo un potencial específico del analito, de forma que cuando ese analito presente en la celda llegue a la superficie electródica, se oxide. El potencial será el potencial específico de oxidación del analito.
• Detector de absorción molecular UV: Al interaccionar radiación-materia, el analito sufre una modificación y, como consecuencia de esa interacción, vamos a obtener un espectro de radiación continua que será específico del analito. Necesito también un soporte para la materia, que será una cubeta de cuarzo.

La ventaja de poner estos 2 detectores en línea es que así aumento la sensibilidad. La amperometría de oxidación es una técnica mucho más selectiva que la absorción molecular, ya que solo va a dar señales de aquellas moléculas que se oxiden. Sin embargo, con la absorción molecular me aseguro de recoger las señales de todos los compuestos que estén en mi fase móvil, ya que es una técnica universal (poco selectiva) con la que prácticamente todos los compuestos pueden ser analizados.

6. Método de cuantificación

Para el método de cuantificación seleccionamos el método de patrón interno (PI) debido a que, al inyectar la muestra con una jeringa, suele cometerse un error. Por tanto, realizamos un calibrado referido a un compuesto que escogemos como PI. Preparamos un calibrado de forma que a cada disolución patrón y a la muestra problema le añadimos la misma cantidad de PI. Realizamos la medida de la señal analítica y hacemos un ajuste lineal representando la señal del analito (Señal_A) dividida por la señal del PI (Señal_PI) frente a la concentración de analito. Al dividir, nos aseguramos de minimizar el error cometido en cada inyección. Finalmente, el valor de Señal_A/Señal_PI obtenido para la muestra problema se interpola en el ajuste.