Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE): protocolo y reactivos

Reactivos para la práctica 5: Electroforesis en geles discontinuos de poliacrilamida en presencia de SDS

• Acrilamida 40%
• Metilen-bis-acrilamida 2%
• SDS
• TEMED
• Persulfato amónico
• Tris
• Glicina
• HCl
• Metanol
• Ácido acético
• Azul Coomassie
• 2-β-mercaptoetanol
• Azul de bromofenol
• Hielo

Procedimiento

1. Limpieza de los cristales

   Limpiar los cristales con agua abundante y después con etanol y acetona para eliminar restos de grasa.

2. Montaje de los cristales

   Montar los cristales en el sistema de electroforesis.

3. Preparación del gel separador

   Se preparan 30 ml de volumen final de un gel al 12% de acrilamida/bisacrilamida.
4. Verter la mezcla entre los dos vidrios hasta una altura de 2,5 cm desde el borde superior, dejando un pequeño volumen en el vaso de precipitado para comprobar la polimerización.
5. Añadir con cuidado 0,2 ml de isopropanol para definir perfectamente el borde del gel y evitar ondulaciones. Una vez polimerizado, se elimina todo el isopropanol antes de añadir el gel apilador.

6. Preparación del gel apilador

   Se preparan 10 ml de volumen final de un gel al 4% de acrilamida/bisacrilamida.
7. Cuando el gel separador haya polimerizado completamente, verter el gel concentrador hasta rellenar todo el espacio entre los vidrios e inmediatamente colocar el peine que definirá los pocillos para las muestras.
8. Una vez polimerizado, quitar el peine en vertical y con cuidado.
9. Rellenar los pocillos con tampón Tris pH=8,3 y, con una pipeta, eliminar el tampón.

10. Preparación de las muestras

    Se preparan las muestras mezclándolas con el tampón de carga de la siguiente manera:
    • 10 µl de muestra
    • 10 µl de tampón de carga (Tris/HCl 0,125 M pH 6,8; SDS 4%; Glicerol 20%; azul de bromofenol 0,1%)
    • 2 µl de 2-β-mercaptoetanol
11. Calentar la mezcla en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos.
12. Pasar a hielo.

13. Electroforesis

    Colocar el portador de geles en el aparato de electroforesis, eliminar todo el tampón y rellenar la cubeta con 300 ml del tampón de electrodo compuesto por:
    • Tris-base 0,025 M, pH 8,3
    • Glicina 0,192 M
    • SDS 0,1%
14. Aplicar el campo eléctrico a 200 voltios. Una vez transcurrida la electroforesis, desconectar la fuente de alimentación.

15. Tinción

    Retirar los cristales y ponerlos a teñir manteniéndolos en una solución compuesta por:
    • Metanol 40%
    • Ácido acético 10%
    • Coomassie Blue R-250 0,125%