Enzimas: Cinética, Mecanismos y Aplicaciones en Bioquímica
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Sitio Activo y Especificidad
El sitio activo es la región de la enzima que reconoce y se une al sustrato. Las enzimas son específicas para un sustrato y un tipo de reacción (redox, hidrólisis, transferencia, fosforilación). Son saturables, no modifican el equilibrio y son regulables (pH, temperatura y sustrato).
Sustrato Favorito de la Hexoquinasa
La glucosa es el sustrato favorito de la hexoquinasa, presentando una menor Km y, por lo tanto, una mayor afinidad.
Influencia del pH en la Actividad
El pH influye en la carga y el estado de ionización de los aminoácidos del sitio activo, afectando la actividad enzimática.
Aminoácidos en el Sitio Activo
Los aminoácidos presentes en el sitio activo pueden ser:
- Polares: serina, tirosina, asparagina
- Básicos: lisina, histidina, arginina
- Ácidos: ácido glutámico y aspártico
Factores que Influyen en la Actividad Enzimática
Los factores importantes para la actividad de las enzimas son: concentración de sustrato, concentración de la enzima, temperatura, pH, fuerza iónica e inhibidores.
Desnaturalización
La desnaturalización es la pérdida de la actividad y función de la enzima.
Cofactores y Coenzimas
Los cofactores son moléculas necesarias para acelerar una reacción (metales). Los oligoelementos presentes en los alimentos actúan como coenzimas, derivadas de vitaminas (complejo B), que participan en diversas reacciones.
Estado de Transición
El estado de transición es el nivel más alto de energía en una reacción, representando el estado intermediario.
Medición de la Actividad Enzimática
La actividad enzimática se puede medir a través de la energía, la desaparición del sustrato y la formación del producto.
Cinética Enzimática
Saturación Enzimática
Si se agrega más enzima cuando ya está saturada, la velocidad aumenta hasta que se satura nuevamente.
Curva de Progreso
Agregar más enzima no altera el equilibrio, lo cual se refleja en la curva de progreso. De esta curva se puede obtener información sobre el equilibrio y las velocidades iniciales.
Curva de Saturación
De la curva de saturación se obtiene la Vmax y la Km.
Km
La Km es la concentración de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la Vmax.
Constante Catalítica
La constante catalítica representa la velocidad a la que una enzima transforma el sustrato en producto.
Estructura y Función de Proteínas
Estructura Cuaternaria
La estructura cuaternaria se compone de dos o más cadenas polipeptídicas.
Enlaces Disulfuro
Los enlaces disulfuro, formados entre dos cisteínas, contribuyen al plegamiento de la estructura terciaria y a la regulación de procesos metabólicos. Pueden estabilizar regiones específicas de la proteína, como la hélice alfa o la lámina beta.
Punto Isoeléctrico
El punto isoeléctrico es el pH al cual la proteína tiene una carga neta cero.
Inhibición Enzimática
Inhibidor Competitivo
El inhibidor competitivo compite con el sustrato por el sitio activo. Para liberar la enzima del inhibidor, se debe aumentar la concentración de sustrato. En este caso, la Vmax no varía, pero la Km aumenta.
Inhibidor No Competitivo
El inhibidor no competitivo se une a un sitio alostérico, diferente del sitio activo. En este caso, la Vmax disminuye y la Km no varía.
Medición de la Actividad Enzimática y Modelo de Michaelis-Menten
La actividad enzimática se mide mediante la formación de producto en el tiempo, en condiciones constantes de temperatura y pH, variando la concentración inicial de sustrato. El modelo de Michaelis-Menten utiliza los parámetros Vmax y Km, obtenidos de la curva de saturación.
Influencia del pH
El pH altera el estado de ionización de los residuos del sitio activo, influyendo en la actividad enzimática.
Energía Libre de Activación
Las enzimas aceleran las reacciones químicas disminuyendo la energía libre de activación (ΔG).
Cinética de Enzimas
La cinética de enzimas se estudia manipulando la cantidad de sustrato inicial (V0, Km y Vmax).
Hemoglobina y Mioglobina
Hemoglobina
La hemoglobina transporta O2, pudiendo unir hasta cuatro moléculas de oxígeno. Es una proteína alostérica, lo que significa que une más de un ligando y la unión del O2 muestra cooperatividad. La afinidad por el oxígeno está influenciada por el pH, el CO2 y el 2,3-difosfoglicerato. La afinidad aumenta por el cambio de conformación: la forma desoxigenada (T, tensa) tiene baja afinidad, mientras que la forma oxigenada (R, relajada) tiene alta afinidad. La hemoglobina en adultos está compuesta por dos subunidades alfa y dos beta (α2β2), mientras que en fetos y neonatos está compuesta por dos subunidades alfa y dos gamma (α2γ2).
Mioglobina
La mioglobina almacena O2. Es una molécula con una sola cadena de aminoácidos y puede unir una molécula de oxígeno. El grupo prostético hemo es el responsable de la unión al oxígeno.
Técnicas de Laboratorio
Centrifugación
La centrifugación es un método para separar sólidos de líquidos de diferente densidad mediante una fuerza giratoria.
Homogenización
La homogenización busca la representatividad de la muestra, disminuyendo el tamaño de las partículas mediante técnicas de trituración y/o pulverización.
Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (PAGE)
La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) tiene un gran poder de separación por carga y tamaño. Los geles son químicamente inertes, transparentes (permiten densitometría), estables (pH, fuerza iónica, temperatura) y versátiles en cuanto al tamaño de poro y entramado uniforme. El SDS-PAGE separa por tamaño, mientras que el PAGE separa por carga y tamaño.