Técnicas de Hibridación Molecular: Southern Blot, Microarray, FISH y CISH

Técnicas de Hibridación Molecular

Southern Blot

Separación electroforética: El primer paso es digerir el ADN diana con enzimas de restricción. Los fragmentos resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis en gel. Durante la electroforesis, los fragmentos de ADN cargados negativamente debido a los grupos fosfato migran desde el polo negativo hacia el positivo a través de un gel poroso de agarosa. Los fragmentos pequeños corren más rápido y a medida que aumentan de tamaño se desplazan a menor velocidad.

Desnaturalización: Tras la electroforesis, los fragmentos de ADN se hidrolizan parcialmente con un ácido débil y se desnaturalizan con una base fuerte para permitir la transferencia.

Transferencia: Debido a la fragilidad de los geles de agarosa, el ADN se transfiere a un filtro de nitrocelulosa o de nailon. Los fragmentos de ADN quedan inmovilizados en distintas posiciones según su tamaño.

Hibridación: Los fragmentos monocatenarios de ADN diana fijos en el filtro se asocian (hibridan) con sondas monocatenarias de ADN marcadas. Durante la incubación, las sondas hibridarán solo con las secuencias de ADN diana complementarias y su posición en la membrana puede correlacionarse con el gel para estimar su tamaño.

Detección: La sonda unida a la diana complementaria se visualiza en el filtro mediante la exposición a rayos X (si se han utilizado sondas con marcado radioactivo) o con una película sensible a la luz (si se han marcado con fluorocromos). Su posición en la membrana puede correlacionarse con el gel para estimar su tamaño.

Aplicaciones del Southern Blot:

• Elaboración de huellas genéticas
• Estudio de mutaciones estructurales
• Detección de secuencias adquiridas

Microarray

En todos los protocolos hay unos pasos comunes:

• Marcaje de la muestra: Las sondas fijadas al microarray no están marcadas, por lo que el primer paso consiste en marcar la muestra con un fluorocromo.
• Hibridación y lavados posthibridación: Se llevan a cabo siguiendo la rigurosidad recomendada por el fabricante.
• Lectura del microarray: Se realiza mediante un escáner con luz láser que excita cada punto de la matriz con la longitud de onda adecuada al fluorocromo utilizado y un detector que mide la intensidad de la fluorescencia emitida.
• Análisis e interpretación de los resultados: Se realiza mediante software específico.

Hibridación In Situ (FISH y CISH)

Características de las técnicas de hibridación in situ:

• No requiere la extracción y purificación previa de ácidos nucleicos.
• Es relativamente rápida y sencilla, con un coste económico moderado.
• Se puede realizar sobre material fresco, congelado e incluso fijado en formol e incluido en parafina.
• Permite obtener información a nivel de célula individual en relación con el resto del tejido.
• Posibilita la realización de estudios retrospectivos.
• Utiliza sondas no radioactivas, tanto de ADN como de ARN y PNA.

FISH (Hibridación in Situ Fluorescente)

Protocolo FISH:

Hibridación: Se aplican 5 μl de la sonda marcada en el área de hibridación. El portaobjetos se coloca sobre una placa calefactora a 72 °C durante 4-5 minutos para desnaturalizar el ADN. Se incuba en una cámara húmeda a la temperatura recomendada (37-42 °C) durante 12-16 horas.

Lavado poshibridación: Se realiza por inmersión de los portaobjetos en soluciones de lavado.

Contratinción: Se utiliza DAPI para teñir los núcleos de azul. Se puede visualizar con microscopio de fluorescencia.

Visualización: Se realiza con un microscopio de fluorescencia con los filtros adecuados.

CISH (Hibridación in Situ Cromogénica)

Protocolo CISH:

Desparafinado y rehidratación: Se elimina la parafina mediante disolventes orgánicos y se rehidrata el tejido con alcoholes y agua.

Digestión enzimática: Se utiliza proteinasa K o pepsina para permeabilizar el tejido.

Prehibridación: Se bloquea la unión inespecífica de la sonda con ADN de esperma de salmón.

Hibridación: Se deposita la sonda, se coloca un cubreobjetos y se calienta a 95 °C durante 5-10 minutos. Se incuba en cámara húmeda.

Lavado poshibridación: Se lavan los portaobjetos en soluciones de poshibridación.

Detección del híbrido: Se utilizan métodos inmunohistoquímicos indirectos para obtener un producto coloreado.

Contratinción: Se tiñe el tejido con una tinción suave para visualizar el contexto morfológico.

Visualización: Se realiza con un microscopio óptico de luz transmitida.