Técnicas Inmunológicas: Aglutinación, Precipitación y Métodos de Detección de Inmunocomplejos

Técnicas Inmunológicas: Aglutinación y Precipitación

Este documento describe diversas técnicas inmunológicas utilizadas para la detección y cuantificación de antígenos y anticuerpos, incluyendo métodos de aglutinación y precipitación.

Aglutinación

La aglutinación se basa en la capacidad de un antígeno (Ag) de unirse a un anticuerpo (Ac) formando inmunocomplejos. El Ag debe ser multivalente (tener varios puntos de unión para el Ac). La aglutinación se produce cuando las concentraciones de Ag y Ac son equivalentes. Un exceso de alguno de los dos puede causar el efecto zona.

Tipos de Aglutinación

• Aglutinación Directa: Detecta la reacción de aglutinación de algún inmunocomplejo. Se usa una suspensión de Ag que tienen en su membrana determinantes antigénicos que forman los inmunocomplejos.
• Aglutinación Indirecta: Se emplea un Ag inicial soluble que se insolubiliza fijándolo a un soporte sólido, obteniendo así un Ag particulado.

Ejemplos de Aglutinación

• Aglutinación en Placa: (Aglutinación Directa) Clasificación: (aglutinación directa). Muestra: (suero del paciente). Qué busca: (anticuerpos). Reactivo: (antígenos). Si aglutina, el Ag se une al Ac.
• Hemaglutinación Directa: Clasificación: (directa). Muestra: (sangre). Qué busca: (antígeno). Reactivo: (anticuerpos). Aglutina hematíes al unirse al Ac.
• Látex en Placa: (Aglutinación Indirecta) Clasificación: (indirecta). Muestra: (suero). Qué busca: (anticuerpos). Reactivo: (antígenos). Aglutina al unirse al Ac.
• HAI (Inhibición de la Hemaglutinación): Clasificación: (indirecta). Muestra: (suero). Qué busca: (anticuerpos). Reactivo: (hematíes de ave tratados).
• Inhibición de la Hemaglutinación (IHA): Clasificación: (aglutinación indirecta). Muestra: (suero). Qué busca: (anticuerpos). Reactivo: (eritrocitos de ave o virus). Aglutina en forma de botón, no aglutina en forma de velo.
• Coombs: Clasificación: (directa e indirecta). Muestra: (sangre para la directa, suero para la indirecta). Qué busca: (anticuerpos). Reactivo: (directa: hematíes y Coombs; indirecta: Ac antihumanos y Coombs).
  • Directa: Positiva si el paciente tiene Ac en sus hematíes y está enfermo; negativa si el paciente no tiene Ac en sus hematíes y está sano.
  • Indirecta: Positiva si la madre está sensibilizada; negativa si la madre no está sensibilizada.

Aglutinación en placa o hemaglutinación directa

Determina ABO y Rh. Los anticuerpos contra los antígenos ABO son isohematíes (antígenos humanos). El suero que tiene los anticuerpos contra los antígenos A y B va a hacer que aglutinen los eritrocitos que tengan en su membrana el antígeno. Para saber el antígeno y cuál grupo, se pone anticuerpo monoclonal contra el antígeno y si aglutina está en el hematíe.

Aglutinación látex placa

Las partículas de látex son esferas suspendidas en solución amortiguada. Las partículas se adhieren a antígeno-anticuerpo gracias a interacciones hidrofóbicas. La partícula al estar sensibilizada detecta al antígeno o anticuerpo específico.

Hemaglutinación indirecta

Uso de antígenos de hematíes como soporte, se emplea una placa de microtitulación con diluciones seriadas. Se necesita suero del paciente frente al antígeno de la sífilis, hematíes de ave con antígeno de la sífilis (células test), hematíes de ave sin antígeno de la sífilis (células control) y control positivo y negativo. Como esta técnica usa hematíes de ave sensibilizados con el antígeno que buscamos, el problema radica en que el uso de hematíes como partícula sensibilizada puede provocar aglutinación no porque el suero sea positivo, puede ser que la aglutinación se produzca porque el suero del paciente tenga hemaglutininas, es decir, anticuerpos que aglutinen los antígenos propios del hematíe. Es por eso que hay que usar controles positivos y negativos para saber si la aglutinación se está produciendo por la positividad del suero o por la presencia de hemaglutininas.

Inhibición de la hemaglutinación

Capacidad de byv de unirse a receptores de membrana de aves y mamíferos. NO HAY AGLUTINACIÓN (suero problema para detectar anticuerpos específicos, si no hay anticuerpos específicos los antígenos aglutinan eritrocitos) porque al ser positivo para el antígeno desde un principio, la fracción Fab de los anticuerpos está bloqueada por dicha unión al antígeno y al añadir el látex con el mismo antígeno no se puede producir la unión porque los anticuerpos ya están unidos a algo (antígeno inicial) y al no poder unirse no se produce aglutinación y por tanto es positivo. HAY AGLUTINACIÓN (suero con anticuerpos específicos, los anticuerpos neutralizan antígenos por lo que no aglutinan) porque el suero desde un principio no tenía antígeno y por lo tanto los anticuerpos bloqueantes tenían su fracción Fab libre para unirse después a los antígenos de la partícula de látex dando aglutinación y por lo tanto ser negativo.

Coombs

El reactivo de Coombs es un antisuero animal contra globulina humana por lo que contiene anticuerpos contra inmunoglobulinas humanas.

• Directo: Detecta anticuerpos contra eritrocitos, se usa en hijos Rh-. Detecta anticuerpos o componentes del complemento adheridos a los glóbulos rojos del paciente in vivo mediante la adición de reactivo de Coombs directamente a una muestra de glóbulos rojos lavados; si hay anticuerpos presentes, se observa aglutinación. Es útil para diagnosticar anemia hemolítica autoinmune.
• Indirecto: Identifica anticuerpos libres en el suero que podrían unirse a glóbulos rojos in vitro. Se realiza mezclando el suero del paciente con glóbulos rojos de un grupo conocido, incubando, lavando para eliminar el exceso de suero y añadiendo reactivo de Coombs; la aglutinación indica un resultado positivo. Mientras el directo evalúa fenómenos ya ocurridos, el indirecto predice riesgos futuros como reacciones transfusionales o incompatibilidad materno-fetal.

Precipitación

Las técnicas de precipitación se basan en la formación de inmunocomplejos insolubles entre antígenos y anticuerpos.

Tipos de Precipitación

• Precipitación en Medio Líquido:
  • Inmunoturbidimetría: Clasificación: (precipitación en medio líquido). Muestra: (suero). Qué busca: (anticuerpos de IgG, IgA, IgM). Reactivo: (antisuero con anti-IgA, anti-IgG, anti-IgM). Positivo con inmunocomplejo que genera turbidez medible a 365 nm; negativo si no hay turbidez ni inmunocomplejo.
  • Inmunonefelometría: Clasificación: (precipitación en medio líquido). Muestra: (suero). Qué busca: (antígeno). Reactivo: (anticuerpos monoclonales). Positivo si el inmunocomplejo dispersa la luz; negativo si no hay inmunocomplejo.
• Precipitación en Gel: Se usa un soporte semisólido. Las concentraciones equiparables de antígeno y anticuerpo forman inmunocomplejos que dan bandas. La velocidad de difusión del antígeno y anticuerpo depende de la concentración, viscosidad y tamaño. El número de bandas representa el número de inmunocomplejos.
  • Doble Difusión o Ouchterlony: Los antígenos y anticuerpos se difunden libremente por el gel. Cuando encuentran la reacción equivalente, forman un precipitado. La banda aparece en el pocillo menos concentrado y de mayor tamaño. Cuanta menos concentración, menos distancia recorre el anticuerpo para encontrar su equivalente del antígeno. En el pocillo central se sitúa el anticuerpo comercial y en los periféricos el suero problema con los antígenos.
  • Difusión Radial o Mancini: Difusión de un componente de la reacción por el gel que lleva otro componente. Los complejos son anillos cuyos diámetros son proporcionales a la concentración del componente que se difunde por el gel. El antígeno se difunde de manera circular hasta que reacciona con el anticuerpo y forma un anillo. El área del anillo es directamente proporcional a la concentración de antígeno de la muestra.
  • Inmunoelectroforesis: Esta técnica se realiza cuando la mezcla antigénica es demasiado compleja y los antígenos han de separarse antes de ser visualizados por precipitación. Consta de dos etapas:
    1. Se realiza una electroforesis: para separar los componentes de una muestra antigénica: La muestra se deposita en un pocillo central escavado un gel de agar o de agarosa y se hace pasar la corriente eléctrica a través del medio, con el objetivo de separa los antígenos proteicos en función de su carga eléctrica neta y su PM. El medio debe estar tamponado a un pH determinado.
    2. Se añade el antisuero (anticuerpo) en un surco y se deja que difundan hasta producir unos arcos de precipitación en las zonas en las que el Ac y el Ag han reaccionado a concentraciones equivalentes.
    • Hipergammaglobulinemia: línea más cerca al canal del antisuero y más gruesa.
    • Hipogammaglobulinemia: línea más alejada al canal y más fina.
    • Gammapatía monoclonal: la Ig normal desaparece por el efecto zona. Curva por encima, curva por la derecha, curva altísima.
  • Inmunofijación: En suero consiste en la detección, mediante electroforesis alcalina en gel de agarosa y uso de anticuerpos, de proteínas monoclonales en suero. Las proteínas migran en la electroforesis y se inmunofijan con antisueros de diferentes especificidades: anti-gamma, para la detección de inmunoglobulina G (IgG). Posterior a la inmunofijación, las proteínas que se precipitan se tiñen con violeta ácido para permitir su visualización. La inmunofijación en suero está indicada en los pacientes que presentan un pico en las regiones beta o gamma de la electroforesis de proteínas en suero y que tienen sospecha de neoplasia de células plasmáticas, especialmente mieloma de células plasmáticas (también conocido como mieloma múltiple).
    1. Separación de las proteínas mediante electroforesis en gel de agarosa.
    2. Fijación e inmunoprecipitación de las proteínas: se adicionan los antisueros (Anti IgG, Anti IgM, Anti IgA, Anti-kappa y Anti-lambda y las soluciones fijadoras sobre la superficie del gel para identificar las proteínas específicas y precipitarlas.
    3. Lavado de proteínas solubles que no se precipitaron ni se unieron a los antisueros.
    4. Tinción de las proteínas precipitadas para permitir su visualización.
    5. Comparación de las bandas inmunoprecipitadas con las bandas anormales observadas inicialmente en la electroforesis de proteínas.

    Interpretación: La presencia de una proteína monotípica por lo general se identifica por una banda muy definida y delimitada que reacciona con un anticuerpo contra cadena pesada y con uno contra cadenas ligeras; ambas bandas migran en la misma distancia.

  • Contrainmunoelectroforesis: Esta técnica es una doble difusión forzada por una corriente eléctrica lo que permite acortar el tiempo y aumentar la sensibilidad de la técnica. Se realiza en geles de agar o agarosa, eligiendo el pH del medio de tal forma para que los Ac se carguen + y migren al polo - y los Ag se carguen - y migren al polo +. De esta forma el Ac y el Ag están enfrentados y migran hasta encontrarse y precipitarse.
  • Electroinmunodifusión o Inmunoef Rocket (cuantitativa): Se realiza una inmunodifusión radial forzada por aplicación de corriente eléctrica, lo que, al igual que en el caso anterior, acorta el tiempo de aparición de los resultados y facilita la lectura de los mismos. Se realiza sobre una placa de gel de agar o agarosa donde va disuelto el Ac. El pH del gel se elige para que los Ac tienen carga neta neutra y no migren bajo la acción de un campo eléctrico. En los pocillos situados en un extremo del gel se ponen los patrones estándar a diferentes concentraciones de Ag y los sueros problema con el Ag. Se aplica la corriente eléctrica y los Ag migran por el gel y al encontrarse con el Ac se forman precipitados en forma de cohetes. La altura del cohete es proporcional a la concentración del Ag de la muestra. Con la lectura de los patrones estándares se construye una curva patrón y en ella se leen las concentraciones de Ag en los sueros problema.

Técnicas de Turbidimetría y Nefelometría

• Inmunoturbidimetría: Mediante la turbidimetría se puede comparar la intensidad del rayo de luz emergente con la del rayo incidente, y teniendo en cuenta que existe relación entre la concentración del analito y la transmitancia medida en un espectrofotómetro, se puede determinar la concentración de analito. La inmunoturbidimetría aplica este principio, midiendo la concentración de complejo inmune que se forma (es el analito en este caso). Se utiliza para muestras que contienen grandes concentraciones de partículas dispersantes (antitrombina 3 e IgG, IgA). Si se aplica a la determinación cuantitativa de IgA, IgG e IgM en suero humano, se utilizan antisueros con anti-IgA, anti-IgG y anti-IgM, respectivamente.
• Inmunonefelometría: Cuando la muestra contiene pequeñas concentraciones de partículas dispersantes, es más recomendable recurrir a la inmunonefelometría que a la inmunoturbidimetría. Siempre que se disponga de los anticuerpos monoclonales necesarios, se puede aplicar a la estimación de Ig, componentes del complemento (C3, C4), haptoglobina, proteína C reactiva, etc. Esta técnica mejora la sensibilidad utilizando un láser (luz monocromática) y agregando polietilenglicol a la solución, lo que aumenta el tamaño del agregado. Los complejos antígeno-anticuerpo formados se cuantifican mediante el gradiente de difracción del rayo láser que producen. Se mide la dispersión de la luz en un ángulo aproximado de 70°. La principal limitación de esta técnica radica en la interferencia que puede causar la turbidez propia de la muestra, ya sea por la presencia de complejos inmunes preexistentes o de otros agregados moleculares insolubles de origen no inmunológico. Este aspecto se controla mediante la utilización de un «blanco» de muestra. Es un método sensible, reproducible y rápido, gracias al grado de automatización de los nefelómetros disponibles actualmente en el mercado. Los nefelómetros más simples se basan en una lectura de punto final; se utiliza un exceso de anticuerpos que se van añadiendo a la muestra hasta llegar al punto de equivalencia, momento en que se realiza la medida de la luz dispersada. Existen otros modelos de nefelómetros más sofisticados, que utilizan un sistema de lectura continua para computar la cinética de la formación de los complejos, es decir, el cambio de señal por unidad de tiempo.

Vías de Activación del Complemento

El sistema del complemento se activa a través de tres vías principales:

• Vía Clásica: c1q, c1r, c1s, c4 (deriva a c4b y c4a), c4b (deriva a c2a y c4b2b), c4b2b (deriva en c4b2b3b y c3), c4b2b3b (deriva en c5).
• Vía de la Lectina: MASP (se va a c4 y a c4b2b).
• Vía Alternativa: c3 (deriva en c3a y c3b), c3b, c3bBb (deriva en c3 y c3bBb3b). c3: c3a/c3b (se va a c4b2b3b que va a c5 y se subdivide en c5a y c5b O se va a c3bBb3b).

c3b opsoniza, c3a libera fragmentos quimiotácticos (anafilotoxina). c4b2b3b es convertasa de c5 (da c6, c7…). Todas llegan a c5.

A: anafilante, B: opsonizante. Las convertasas tienen una línea arriba y pueden hidrolizar.

Turbidimetría y Nefelometría

• Turbidimetría: Se hace pasar luz por una suspensión de partículas y se mide la cantidad de luz absorbida. A más luz absorbida, más inmunocomplejos y más concentración en la sustancia problema.
• Nefelometría: Mide la luz dispersada por el inmunocomplejo con un ángulo determinado respecto al rayo incidente. La luz dispersada es proporcional a la concentración del inmunocomplejo, que a su vez es proporcional a la cantidad de antígeno y anticuerpo de la muestra.