Técnicas de Laboratorio en Inmunohematología: Pruebas Cruzadas, Reacciones de Aglutinación y Materiales

Pruebas Cruzadas en Transfusiones Sanguíneas

Las pruebas cruzadas son ensayos realizados con la sangre de donante y receptor antes de realizar una transfusión. Deben incluir dos temperaturas (22 y 37ºC) en fase salina, fase albuminosa y fase de Coombs.

Tipos de Pruebas Cruzadas

• Prueba cruzada mayor: Se realiza con suero del receptor y hematíes del donante. Detecta anticuerpos en el receptor frente a los hematíes del donante.
• Prueba cruzada menor: Se realiza con suero del donante y hematíes del receptor. Los problemas que pueden ocurrir son menores, sobre todo cuando se utilizan concentrados de hematíes.

Resultados de las Pruebas Cruzadas

• Si la sangre es compatible, no aparece aglutinación ni hemólisis.
• Si aglutina la mayor, indica presencia de anticuerpos del receptor frente a la sangre del donante.
• Si aglutina la menor, indica presencia de anticuerpos en el suero del donante o hematíes sensibilizados en el receptor (Coombs directo).

Errores Técnicos en las Pruebas Cruzadas

• Lavado insuficiente de los hematíes.
• Hemólisis en el sobrenadante.
• Se debe realizar la lectura en un visualizador.

Detección de Anticuerpos Irregulares

Los anticuerpos irregulares se detectan en el suero del paciente. Son anticuerpos de otros grupos que no son ABO. Son todos los anticuerpos del sistema ABO que no son naturales. Si eres A, tienes anti-B.

Utilidad de la Detección de Anticuerpos Irregulares

• Discrepancia entre grupo hemático y sérico.
• Reacciones transfusionales.
• Ictericia del recién nacido.

Técnica para la Detección de Anticuerpos Irregulares

Se enfrenta el suero problema a hematíes del grupo O que contengan todos los antígenos posibles de grupos conocidos:

• Medio salino a temperatura ambiente.
• Albúmina a temperatura ambiente y a 37ºC.
• Aglutinación con hematíes tratados con enzimas proteolíticas que favorecen la aglutinación (tripsina, papaína).
• Coombs indirecto.
• Control de Coombs.

Identificación y Titulación de Anticuerpos Irregulares

• Identificación: Mediante un panel de hematíes con antígenos conocidos.
• Titulación: Se realiza mediante diluciones seriadas en base 2.

Pruebas Previas a una Transfusión

• ABO y Rh de donante y receptor.
• Prueba cruzada.
• Coombs directo en donante y receptor.
• Anticuerpos irregulares en el receptor.
• En algunos casos: prueba cruzada menor y autocontrol (suero del receptor con una suspensión de sus propios hematíes).
• Serología del donante: lúes, hepatitis, SIDA.

Reacciones de Aglutinación

Fundamento

Reacción obtenida al unirse un antígeno particulado (aglutinógeno) con su anticuerpo específico (aglutinina). Son reacciones antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) en las cuales el antígeno es un antígeno forme o particulado, es decir, está en la superficie de una célula, partícula o bacteria. El antígeno está en suspensión y la reacción consiste en la aglomeración del complejo en suspensión. Si el antígeno es soluble, se puede realizar la aglutinación si previamente hemos unido el antígeno a una partícula inerte como carbón vegetal, látex o gelatina.

Componentes de las Reacciones de Aglutinación

• Aglutinógeno: Es la sustancia que actúa como antígeno y estimula la producción de aglutininas. Debe:

  • Estar presente en forma apreciable.
  • Estar situado en la superficie de una partícula.
  • Poseer múltiples epítopos.

• Aglutinina: Es el anticuerpo capaz de producir aglutinación. Puede ser de dos tipos:

  • Completas: Siempre producen aglutinación (IgM).
  • Incompletas: No siempre producen aglutinación (IgG).

Tipos de Partículas Antigénicas

• Vitales: Hematíes (hemaglutinación), leucocitos, bacterias.
• Inertes: Carbón, látex, bentonita, gelatina. A estas partículas van unidos antígenos solubles.

Factores que Influyen en las Reacciones de Aglutinación

• Concentración de antígeno y anticuerpo: Debe estar equilibrada. En caso contrario, se producirá el fenómeno de zona (falso negativo).
• Temperatura: Algunas aglutininas reaccionan mejor a 37ºC y otras a 4ºC (crioaglutininas). La mayoría reacciona a temperatura ambiente (20ºC).
• Carga de las partículas: Impide la reacción, por lo que se debe eliminar con papaína o albúmina.
• Tipo de aglutinina: Las más aglutinógenas son las IgM.
• Tipo de aglutinógeno: Muchos determinantes y muy juntos, mejor aglutinación.
• Concentración de electrolitos y viscosidad.
• Tiempo de incubación: A partir de un tiempo, los aglomerados pueden desaparecer, dando falsos negativos.

Métodos para Favorecer la Aglutinación

1. Aumentar la viscosidad con albúmina.
2. Eliminar las cargas negativas con enzimas como la tripsina o la papaína.
3. Disminuir la concentración de iones empleando glicinato sódico en solución salina (LISS).

Tipos de Aglutinación

Aglutinación Directa o Activa

Las aglutininas reaccionan con un antígeno presente de forma natural en la superficie de las células (ejemplo: hematíes).

Utilización

Enfermedades microbianas (Salmonella, Brucella, determinación de grupo sanguíneo).

Métodos

• Cualitativos: En tubo o en portaobjetos. Observar ausencia o presencia de aglutinación.

• Cuantitativos: Determinar la cantidad de antígeno o anticuerpo presente en la muestra problema.

  • Diluciones seriadas: Se cogen varios tubos. Cada tubo tendrá una concentración constante de antígeno y diluciones sucesivas del suero. El título del suero será la inversa del último tubo donde se haya observado aglutinación. La inversa del último título de dilución positiva será el resultado.

Aglutinación Indirecta

Las aglutininas reaccionan con un aglutinógeno transferido pasivamente a una partícula. Es la reacción que se produce entre la aglutinina y un aglutinógeno que ha sido transferido pasivamente a la superficie de una partícula (conversión de un antígeno soluble en un antígeno forme o en suspensión).

• Sensibilización: Proceso mediante el cual las partículas son recubiertas con el aglutinógeno.
• Utilización: Factor reumatoide (FR), VDRL (sífilis), PCR (proteína C reactiva), toxoplasma.

Aglutinación Indirecta Inversa

El aglutinógeno está libre en la muestra y reacciona con el anticuerpo fijado a la superficie de una partícula (Ejemplo: antígeno de hepatitis B reacciona con anticuerpo anti-HBsAg recubierto de partículas de látex).

Aspectos a Considerar en las Reacciones de Aglutinación

Respecto al Material

Se pueden utilizar:

• Portaobjetos.
• Tarjetas visualizadoras.
• Placas de microtitulación.
• Tubos de ensayo.

Respecto a los Resultados

La fiabilidad depende de:

• Los reactivos: Deben conservarse en nevera y comprobar la caducidad.
• Muestra: Suero reciente (-24h), no hemolizado, contaminado ni lipémico (falso positivo). Se puede congelar.
• Látex: Se debe agitar el vial.
• Realizar control positivo y negativo.
• No tocar el portaobjetos con la punta del envase del reactivo.
• Portaobjetos: Limpios y desengrasados.
• Utilizar una varilla diferente para agitar cada muestra.
• Tiempo de lectura: Se debe respetar. Si lo alargamos, podemos obtener falsos positivos o falsos negativos.
• Repetir la prueba a las dos semanas.

Valoración de la Aglutinación

Es difícil de cuantificar. Para dar una idea aproximada podemos:

• Asignar más o menos cruces a la aglutinación, según el número y tamaño de los agregados.
• Semicuantificar: Aplicar diluciones seriadas. La inversa de la máxima dilución positiva es el título.

Sensibilidad

Cantidad mínima o máxima de sustancia problema que se puede determinar.

UMD (Unidad Mínima Detectable o Sensibilidad Mínima)

Cantidad mínima de sustancia problema que se puede detectar.

Tasa

Concentración aproximada de la sustancia: tasa = título x UMD.

Preguntas y Respuestas sobre Aglutinación

¿Qué es el título en una reacción de aglutinación?

Es la máxima dilución a la cual un suero continúa siendo positivo en una prueba serológica determinada. Inversa de la dilución máxima en la que se ha observado aglutinación. (Tasa = 80 * 20).

¿Cómo realizarías un análisis para averiguar el título de anticuerpos que posee un paciente con brucelosis?

Por el método de diluciones sucesivas. Tenemos varios tubos, cada uno con concentración constante de antígeno y diluciones sucesivas de suero. Por lo tanto, el título será la inversa del último tubo donde observemos aglutinación.

¿Qué son las crioaglutininas?

Anticuerpos que actúan mejor a bajas temperaturas.

¿Qué son anticuerpos incompletos?

Anticuerpos que no producen aglutinación siempre. IgG.

¿Cuándo aparecerá el fenómeno de zona?

Cuando la concentración de antígeno y anticuerpo no están en proporciones adecuadas. Si hay exceso de uno de ellos, da falso negativo.

Diferencia entre anticuerpos del sistema ABO y Rh

Unos están de forma natural y otros necesitan contacto. Aglutinación directa o indirecta.

¿Cómo se le considera en un centro de transfusiones a una persona con antígeno Du?

Rh positivo. Si le pones Rh negativo no pasa nada, pero si le pones Rh positivo y es Rh negativo, lo rechaza. Cuando es receptor, se considera positivo. Cuando es donante, tiene antígeno.

¿Qué prueba de Coombs utilizarías en los siguientes casos?

• Detección de hematíes sensibilizados en eritroblastosis fetal: Directo.
• Prevención de enfermedad hemolítica del recién nacido: Indirecto.
• Detección de anticuerpos irregulares: Indirecto.
• Detección de antígenos Rh: Indirecto.
• Estudio de anemias hemolíticas: Directo.
• Reacción postransfusional por sangre incompatible: Indirecto.

¿Cómo actúa la vacuna que se le pone a la madre Rh negativo?

Para bloquear los anticuerpos D, se le inyecta anticuerpos anti-D a la madre después del parto, para que actúen contra los antígenos D. Eso hace que la madre no cree anticuerpos anti-D, así no crea anticuerpos de memoria y no haya riesgo en un segundo embarazo. Bloquea el antígeno D que le pasa el niño para evitar que la madre forme sus propios anticuerpos.

¿Por qué hay que lavar los hematíes tras incubar el suero problema y antes de añadir antiglobulina humana en una prueba de Coombs indirecta?

Para eliminar los anticuerpos que no se han fijado a los hematíes.

¿Qué función tiene la albúmina en la detección de anticuerpos incompletos?

Como los incompletos no siempre aglutinan, hay que ayudarlos para que tengan más densidad.

Características y Usos de las Pipetas

Pipeta 0.1

• Sensibilidad: 1/100
• Tolerancia: 0.002
• Rango de medición: 0, 0.01, 0.05 hasta 0.1

Pipeta 0.2

• Sensibilidad: 1/1000
• Tolerancia: 0.2
• Rango de medición: 0, 0.01, 0.14 hasta 0.2

Pipeta 0.5

• Sensibilidad: 1/10
• Tolerancia: 0.01
• Rango de medición: 0, 0.1, 0.2 hasta 0.5

Pipeta 1

• Tolerancia: 0.004
• Rango de medición: 0, 0.8 hasta 1

Pipeta 2

• Sensibilidad: 1/100
• Tolerancia: 0.02
• Rango de medición: 0, 0.1, 0.2 hasta 2

Pipeta 5

• Sensibilidad: 1/10
• Rango de medición: 0, 1, 2, 5

Pipeta 10

• Sensibilidad: 1/100
• Rango de medición: 0, 1, 2, 10

Clasificación del Material General en un Laboratorio

Según la Naturaleza o Composición del Material

Vidrio

El más utilizado en el laboratorio es el de borosilicato de sodio y aluminio, vidrio Pyrex. Se caracteriza por resistir altas temperaturas, aunque puede ser atacado por ácido fluorhídrico y, a elevadas temperaturas, también por bases o álcalis fuertes y ácido fosfórico concentrado. Precauciones:

• No someter a cambios bruscos de temperatura.
• No aplicar fuerza sobre las llaves o tapones.
• No someterlo a variaciones bruscas de presión.
• No conservar soluciones concentradas de álcalis en vidrio de borosilicato, ya que las condiciones cáusticas de la solución destruyen la calibración del vidrio.

Plástico

Tiene la ventaja de ser irrompible y pesar poco. Algunos pueden contener líquidos a 130ºC, pero no resisten a la llama directa y pueden ser atacados por ácidos fuertes y disolventes orgánicos. Diversos tipos como el teflón y el polietileno.

Porcelana

Compuesto de cerámica vitrificada de gran resistencia térmica y mecánica, por ello se utiliza en la fabricación de morteros y embudos.

Metal

Suele utilizarse como soporte o sujeción y para recoger sólidos, como las cucharillas o espátulas de metal.

Corcho

Material que procede del alcornoque. Se emplea en la fabricación de tapones.

Por su Función o Uso

Material Volumétrico

Para realizar medidas exactas.

Material No Volumétrico

Mide volúmenes aproximados y se utiliza para calentar líquidos o disolver distintos componentes.

Material de Uso Específico

Tiene funciones muy diversas, variadas y concretas.

Material de Soporte y Sostén

Como elemento auxiliar de sujeción y soporte para otros materiales.

Material Volumétrico

Mide el volumen con cierto grado de exactitud. Todo material volumétrico es graduado (lleva una escala para medir distintas capacidades) o aforado (tiene una única señal llamada aforo o enrase que indica la capacidad), calibrado a 20ºC (material que está preparado para que a 20ºC mida exactamente). Error de paralaje: desplazamiento aparente de un objeto cuando se observa desde diferentes puntos. Dicho material viene ajustado por contenido (ajuste In) cuando la cantidad de líquido que abarca corresponde exactamente al volumen marcado en el material, y ajustado por vertido (ajuste Ex) cuando la cantidad vertida corresponde al volumen marcado en el material. Son la probeta, pipeta graduada, aforada, bureta, matraz aforado, dosificador y dispensador automático.

Matraz Aforado

Recipiente de forma cónica en la parte inferior, con cuello largo y estrecho en la parte superior. Lleva una línea de enrase o marca, que es el aforo. En las paredes de este se indica la capacidad y temperatura a la que debe utilizarse. Mide un único volumen que viene indicado en este y se encuentra expresado en mL. Hay de 25, 50, 100, 250, 500 y 1000 mL. Puede ser de vidrio transparente, de vidrio topacio y de plástico de polipropileno (PP). No se pueden calentar ni echar en ellos líquidos calientes. Se emplean en la preparación de disoluciones a concentración exacta y para diluir muestras a volumen fijo. Para preparar una disolución a partir de un producto sólido, se empieza pesando la cantidad necesaria de producto, que se traslada a un vaso de precipitado que contiene un pequeño volumen de disolvente. Una vez disuelto con la ayuda de una varilla de vidrio, y tras comprobar que la disolución está a temperatura ambiente, se trasvasa al matraz aforado mediante un embudo, lavándose varias veces todo el material. Se llena el vaso con disolvente para llegar casi a la línea de aforo y se homogeneiza la disolución por rotación. Por último, se añade con cuidado, mediante pipeta, gota a gota, el disolvente hasta la línea de enrase. Finalmente, se tapa el matraz y se mezcla la disolución mediante movimientos de inversión. Para preparar disoluciones a partir de un líquido (alcoholes), siempre que la reacción no sea exotérmica, se mide el volumen con pipeta o probeta, se deja caer dentro del matraz, donde se había introducido una pequeña cantidad de disolvente de forma que el líquido resbale por las paredes del mismo y luego se añade el resto de disolvente hasta la línea de aforo, de la misma forma explicada en el apartado anterior. En el caso de reacciones, igual que en el caso de sólidos.

Probeta

Tiene forma de cilindro, puede ser de vidrio o plástico y viene graduada en mL y fracciones de mL. Ajustado por contenido, el volumen leído corresponde a la cantidad de líquido contenido. Mide volúmenes que requieren poca precisión o para los que no se pueden utilizar aforados. Varios tamaños: 20, 25, 50, 100, 250, 500 y 1000 cc. Como son graduadas, se pueden utilizar para medir y dispensar volúmenes totales o parciales, con pico en su parte superior, o para contener líquidos, con tapón.