Clonación Molecular: Métodos, Vectores e Aplicacións

Métodos de Clonación Molecular

Clonación molecular: proceso de amplificación in vivo de secuencias de ADN genómico o de ADNc basada en la tecnología de ADN recombinante. El proceso implica:

1. La inserción del fragmento de ADN que se quere amplificar en un vector.
2. La introducción do vector recombinante nunha célula hospedadora.
3. A selección e multiplicación en cultivo das células que portan o ADN recombinante.
4. A recuperación do fragmento amplificado.

Ventajas:

• Permite obter cantidades ilimitadas da secuencia de interese.
• Se poden clonar secuencias de ADN de gran tamaño, dependendo do vector utilizado.
• En un único proceso pódese clonar o xenoma enteiro dun organismo.
• Permite a creación de librerías genómicas.
• Posibilita a expresión de xenes ou de secuencias de interese moi útil na produción de proteínas, hormonas, en investigación, en agricultura ou para a obtención de organismos transxénicos e terapia xenética.

Comparación PCR/Clonación: técnica in vitro/in vivo. Fragmento de ADN se replica en tubo de ensaio/se introduce nunha célula viva. Técnica automatizada (horas)/Técnica manual (días). Cantidades de secuencia limitadas polo nº de ciclos (25-40)/cantidades ilimitadas secuencia. Niveis de amplificación menor/Permite amplificar secuencias de millóns de pares.

Vectores de Clonación

Os vectores de clonación son moléculas de ADN que poden replicarse automaticamente nunha célula hospedadora e que permiten a inserción de ADN estranxeiro, sen perder esa capacidade de replicación autónoma. Actúan como vehículos de clonación, transportando os fragmentos de ADN que se queren clonar ao interior de células hospedadoras, onde se van a replicar. O fragmento de ADN de interese que se introduce no vector de clonación recibe o nome de inserto.

Características:

1. Ten un orixe de replicación.
2. Ten, polo menos, un sitio de inserción de ADN estranxeiro, que son secuencias diana de enzimas de restrición, presentes unha única vez en toda a molécula.
3. Contén algún marcador de selección que permita distinguir as células que portan o vector das que non o portan (xenes de resistencia a antibióticos ou xenes que codifican enzimas que non teñen de maneira natural a célula hospedadora).
4. Contén un marcador de identificación.
5. Os vectores de expresión conteñen un promotor que posibilita a transcripción do inserto e a súa posterior tradución a proteína.

Tipos: Se diferencian por: o orixe da molécula, a disposición dos distintos elementos que o integran e o tamaño do fragmento de ADN estranxeiro que poden incorporar.

1. Plásmidos: moléculas circulares de ADN bicatenario extracromosómico de orixe bacteriano con capacidade autónoma de replicación.
2. Fagos (bacteriófagos): virus que infectan bacterias.
3. Cósmidos: vectores híbridos construídos coas secuencias cos do fago λ e o orixe de replicación dun plásmido bacteriano, un xene de resistencia antibióticos e un polylinker. Insertos de ata 50kb.
4. Fagémidos: vectores híbridos compostos por un plásmido (co seu orixe de replicación bacteriano) ao que se lle insire o orixe de replicación dun fago M13.
5. Cromosomas artificiais: vectores de clonación con capacidade para transportar fragmentos de gran tamaño.
6. Vectores lanzadeira: vectores híbridos que conteñen orixes de replicación de dous hospedadores diferentes, normalmente un de plásmido bacteriano e outro de levadura ou de virus animal, como o SV40.

Células Hospedadoras

Son aquelas nas que se introduce o vector de clonación para a súa amplificación mediante replicación. Cultívase a célula hospedadora co vector en medios adecuados nos que se multiplica, dando lugar a unha progenie de células fillas, todas coa mesma carga xenética, é dicir, un clon. A elección da célula hospedadora depende do vector de clonación empregado e da finalidade perseguida. Os hospedadores poden ser:

1. Células procariotas (bacterias): A bacteria máis usada en clonación é a cepa K12 de E. coli.
2. Células eucariotas: levaduras, células vexetais e células animais.

Fases do Proceso de Clonación

1. Creación dun vector recombinante: (Para a súa creación é necesario preparar o ADN que se vai clonar e o vector de clonación, de maneira que ambos poidan unirse mediante unha ligasa. Para iso é necesario crear extremos cohesivos e complementarios nos extremos de ambas moléculas. A preparación do vector de clonación consiste en digerilo coa mesma enzima de restrición que se utilizou para preparar o ADN que se vai clonar. A. Inserción do ADN estranxeiro no vector).
2. Introdución do vector recombinante na célula hospedadora: (Existen varios métodos para introducir o vector recombinante en células hospedadoras vivas, dependendo do tipo de vector e de célula empregada. Os máis habituais: A. Transformación bacteriana. B. Transfección. C. Transducción. D. Electroporación).
3. Selección e identificación dos clones que portan a secuencia de interese: (A. Xenes de resistencia a antibióticos. B. Enzimas que producen reaccións coloreadas. C. Proteínas fluorescentes. D. Xenes letais).
4. Tasa de transformación: (Mide a eficiencia da introdución do vector na célula hospedadora. Matemáticamente exprésase como: (UFC*VT)/(C*VS) UFC: unidades formadoras de colonias que crecen na placa. VT: volume total da solución na que se realiza a transformación (µL). C: cantidade do vector empregado (mistura que inclúe vector recombinante e vector non recombinante (µg). VS: volume de suspensión bacteriana transformada utilizada para sementar unha placa de medio de cultivo sólido con antibiótico).

Bibliotecas de ADN

Unha biblioteca ou librería de ADN é unha colección de vectores recombinantes clonados cuxas secuencias de ADN estranxeiro se obtiveron dun único organismo.

Tipos:

1. Bibliotecas genómicas: Coleccións de vectores recombinantes clonados que inclúen o xenoma completo dun organismo. Suelen usar vectores de alta capacidade para intentar conter o xenoma completo no menor número de clones. Suelen realizarse en fagos, cósmidos, BAC ou YAC.
2. Bibliotecas cromosómicas: Construídas a partir dun único cromosoma ou fracción cromosómica. Fabricanse partindo dun único cromosoma en metafase, ben por microdisección, centrifugación en gradiente de densidade ou citometría de fluxo.
3. Bibliotecas de ADNc: Obtéñense a partir do ARNm dun tecido ou unha poboación celular determinada, previa transcripción inversa cunha retrotranscriptasa. Cada clon porta un xene completo, pero a súa secuencia difire da secuencia genómica dese mesmo xene, posto que carece de intróns, promotores e secuencias reguladoras.

Análise: Hai que realizar tres pasos principais: 1. A identificación do clon ou clones que conteñen un xene ou unha secuencia concreta. 2. O paseo cromosómico ou identificación de clones que porten secuencias consecutivas. 3. A secuenciación.

Aplicacións da Clonación Molecular

1. Investigación básica: ferramenta imprescindible para descifrar as secuencias xénicas completas de calquera organismo, para estudos filoxenéticos, de diversidade e expresión xénicas.
2. Investigación aplicada: Destaca a clonación en vectores de expresión e a formación de transxénicos.
3. Medicina: Creación de ratos transxénicos e terapia xenética.